【技术干货】双特异性抗体下游纯化技术浅析（上）

 2025/09/23

# 双抗简介 #

双特异性抗体（bispecific antibody, BsAb）是一类能够同时靶向两个不同抗原表位的治疗性抗体。相较于传统单抗，双抗在肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病和感染性疾病中展现出更高的特异性和更低的副作用风险，目前全球已有超14款双抗药物获批上市。

?不同结构双抗的分类与特点

双抗主要由基因重组技术进行生产，分子设计类型多样，满足双抗分子识别两种不同抗原的能力。根据是否含Fc片段可以将双抗分为lgG-like和Non lgG-like 两类。

?IgG-like 双特异性抗体

该类抗体分子含有Fc区,因此保留了 ADCC 和 CDC 效应,可以增强肿瘤的杀伤效果，同时使双抗分子具有半衰期长，稳定性好的优势。

双抗表达时，若分子未特殊设计，理论上会有超过10 种的副产物，主要包括重链之间错配引起的同源抗体 (homodimer Fcspecies)，轻链与重链之间错配引起的异源抗体 (heterodimeric Fcspecies)，结构不完整的片段抗体，如半抗体 (half antibody) 或 3/4 抗体，以及轻链聚集体 (light chain dimer)，重链聚集体 (heavy chaindimer) 等。

图· 双抗重组表达过程中可能产生的副产物类型

?Non lgG-like 双特异性抗体

还有一类双抗分子，即各种不含有Fc区的 Non lgG-like 的双特异性抗体。这些双抗分子结构各异，在临床应用上因为分子体积小，具有免疫原性低，组织穿透能力强的优势；在表达策略上，由于不需要复杂的翻译后修饰可以灵活选择大肠杆菌，酵母菌，CHO 细胞等多种表达体系。由于其分子不含有Fc 区域，下游纯化工艺就不能利用成熟的蛋白A亲和层析方法。

?双抗纯化挑战

所有分子设计策略都只能尽量降低某类副产物的产生，不能完全消除全部的副产物。而且在重组表达过程，还不可避免的会产生不完整的片段抗体以及聚集体，都会给双抗分子的下游工艺开发提出了挑战。

错配问题：在细胞培养过程中，由于多种重链（HC）和轻链（LC）的共表达，双抗容易发生HC和LC的错配现象，导致大量具有相似大小和性质的非功能性或单特异性抗体的产生。若完全随机配对，错配产物的比例可能会超过90%。

片段缺失：缺失HC或LC的双抗片段是常见的副产物。

聚体形成：研究表明，基于片段的bsAb由于Fc区的缺失，比传统的IgG更容易形成聚体。对称型bsAb也被观察到具有较高的聚体倾向（聚体比例高达50%）。这种倾向可能部分是由于链长度和灵活性的增加，导致分子间结构域更容易发生交换。

副产物杂质类型

产品相关杂质：如同源二聚体、片段（缺失重链和轻链的双抗副产物：如半抗体，3/4抗体）、聚集体

工艺相关杂质：如宿主细胞蛋白、病毒、内毒素

?IgG-like BsAb 的下游纯化策略

此类双抗通过重链配对形成lgG样结构，对于lgG-likeBsAb，一般可以去除此类BsAb 中的homodimer, half antibody, light chain relatedimpurity和 aggregate 等常见产品相关杂质。针对 heavychain related impurity的话，去除方法相对简单，一般也可选择 Capto L，KappaSelect又或者是 LamdaFabSelect的亲和填料去捕获，直接流穿重链相关杂质，如 HH。

Homodimer的去除

通常同源二聚体去除较难，其物理化学性质都与目标 BsAb 很相似。Homodimer的去除可以充分利用BsAb 的分子结构设计特点，可选择亲和力差异性与电荷及疏水性差异纯化。

亲和层析

基于Protein A和Protein G的亲和层析，在双抗纯化中，同样发挥关键的蛋白捕获和杂质去除作用。如在中性pH 7.2±0.2条件下平衡并上样。经过缓冲液后平衡，采用低pH值（低于4.0）的醋酸、柠檬酸或甘氨酸缓冲液体系进行等度或梯度洗脱。

Cytiva 有多种Fc结合的亲和层析填料可供选择(如下图)，MabSelect PrismA/Mabselect SuRe LX 载量更高，耐碱性更强，尤其是粒径60 μm的PrismA 可耐受 1.0 M NaOH，150 cycle 的清洗,且具有更高的分辨率,可作为此类分子设计 BsAb 亲和层析的更优选择。

表· Fc结合的亲和层析填料及其结合位点

离子交换层析

去除 homodimer，可以利用其与目标 BsAb 的电荷差异通过盐梯度或 pH 梯度的洗脱方式以去杂。相比之下 pH梯度会比盐梯度表现出更高的分辨率。

新一代Capto SP lmpRes与 Capto Q lmpRes同样是高分辨率的离子填料，其 Capto 基架具备良好的压力流速性能,为后续工艺的生产放大提供了保障,可作为高分辨率类填料中的优先选择

表· 7种不同 BsAb 的 pI分布

复合模式层析

Homodimer的去除也可以利用其与目标 BsAb 的电荷及疏水性差异，复合模式层析填料Capto MMC ImpRes，Capto Adhere 同时具备电荷作用与疏水作用，可有效去除 homodimer。

?Half antibody 的去除

Half antibody是 BsAb 生产中的一种常见杂质，是由无法形成homodimer的重链的过表达而导致的。Half antibody与目标 BsAb 差别较大，一般可以通过亲和力差异性与电荷性质差异来进行纯化。

亲和层析

Half antibody只含有一个 Fc 区域，因此它结合 Protein A填料的能力比含有两个Fc的分子较弱一些。在protein A亲和层析阶段进行 pH线性梯度洗脱，halfantibody将会比目标物略早洗脱。研究表明，在MabSelect PrismA亲和层析中，高载量更容易获得更高的分辨率。

复合模式层析

Capto MMC ImpRes具有CEX 和疏水填料的特性，在合适的实验条件下可以有效去除 half antibody。

离子交换层析

Capto SP lmpRes/Capto slmpAct

在 half antibody的pl与目标 BsAb的差异比较显著的情况下，可通过 CEX 进行纯化，有效去除 halfantibody，并且达到比较高的分辨率。

?Light chain related impurity 去除

Light chain related impurity主要是 BsAb 生产中的出现的一些分子片段，其中 HHL（完整BsAb 上缺了一条轻链）和 HHLLL（完整 BsAb上多了一条轻链）为最难去除的片段杂质。但是即使是与目标 BsAb差别很小的HHL与HHLLL，通过电荷或/及疏水性差异也可以将其有效去除。

多模式层析

Light chain related impurity 主要产生于轻链的断裂，重链的断裂以及二硫键的断裂过程中。Capto Adhere 取代了传统的阴离子层析，也同时保留了阴离子流穿模式病毒去除的效果。

对于极其难以去除的 HHLLL(完整 BsAb 上多了一条轻链),也可以在高分辨率的疏水性较弱的 Butyl Sepharose High Performance 上采用结合洗脱的模式进行有效去除。40 um 粒径的 Capto Butyl lmpRes，同样也是一款高分辨率的疏水性较弱的填料，且其 Capto 基架提供了更优的压力流速性能，为后续的生产放大提供保障。

?Aggregate 的去除

Aggregate，在对称型的lgG-like BsAb 中更容易形成，因为肽链的延伸提高了肽链的长度和灵活性，加剧了分子之间的肽链缠绕。有时候 aggregate 的含量可高达 50%甚至更高。尽管 aggregate 的结合力比目标 BsAb 只略强一些，仍然可以使用亲和层析去除大部分 aggregate，在洗脱液中添加 PEG/CaCl2或 PEG/NaCl 可显著提高目标BsAb 与 aggregate 的分离度。当然，在不添加任何添加剂的情况下，依然通过电荷或/及疏水性差异也可以将其去除殆尽。

复合模式层析

Capto MMC ImpRes具有更细的粒径和更低的配基密度，从而可以提高单体和聚集体的分辨率。该填料在 pH5.0-7.0、0-150 mM NaCl之间可以保证比较高的结合载量，在 pH 5.0条件下，获得的纯度最高。通过盐洗脱的方式可以有效去除 aggregate，但是洗脱峰拖尾比较严重可能是因为疏水作用力在起作用，此时可以用过添加精氨酸 arginine( 破坏电荷相互作用和疏水相互作用)的方式，在保障分辨率的前提下缩小洗脱体积。

Capto Adhere是另一种可以有效去除聚集体的复合模式强阴离子填料。它的配基具有 AEX、HIC 和氢键相互作用等。一般以 FT模式进行聚集体的去除,聚集体的去除效果主要受到 pH，电导和上样量的影响。一般而言，pH 越高，电导越高和/或载量越低更加有利于提高聚集体的去除率。如果 FT模式无法去除，也可以尝试结合洗脱模式。

疏水层析

Capto Phenyl lmpRes，疏水层析技术在 aggregate 去除的应用上非常有效。一般情况下，HIC 可以使 BsAb monomer 通过 FT模式实现与聚集体的分离。

离子交换层析

Capto SP lmpRes/SP HP，CEX在碱性 pH条件下,可以提高对aggregate 的分辨率。